Последние десять лет или около того преимущественно использовались два типа программируемых молекулярных ножниц (рис. 10): нуклеазы «цинковые пальцы», или ZFN (zinc finger nucleases), и нуклеазы TALEN (transcription activator-like effector nucleases – эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции). Нуклеазы ZFN и TALEN похожи в том отношении, что они обе являются гибридными молекулами, состоящими из двух отдельных частей. Первая часть (иногда ее называют «плечом») представлена белком, который опознает часть генома, требующую редактуры, и связывается с ней. Это программируемая часть: каждый «цинковый палец» распознает специфическую последовательность из трех нуклеотидов, а каждый эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE), узнает отдельный нуклеотид. «Цинковые пальцы» или TALE объединяются в цепочки синтетическим путем, так что каждое звено опознает специфическую последовательность ДНК. Второй компонент гибридной молекулы – нуклеаза. Именно нуклеаза разрезает нить ДНК. Она присоединяется к одному из концов цепочки из «цинковых пальцев» или TALE. Для того чтобы внести одно изменение, синтезируются две гибридные молекулы: одна находит последовательность ДНК, расположенную перед целевым фрагментом, и связывается с ней, вторая делает то же самое с участком ДНК, расположенным после целевого фрагмента. После того как обе молекулы обнаруживают нужные места в геноме и связываются с ними, нуклеаза делает разрез.
Рис. 10. Нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN) и эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN). Каждый палец в ZFN распознает специфическую последовательность из трех нуклеотидов, в то время как каждый эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE), узнает отдельный нуклеотид. Плечи образуются при связывании нуклеаз с распознающими специфическую последовательность «цинковыми пальцами» или TALE, так что их последовательность соответствует геномной последовательности, к которой они должны присоединиться
Сделать разрез в нужном месте – это только первая половина работы. Вторая половина заключается в том, чтобы убедить клетку заменить в процессе починки только что поврежденного фрагмента ДНК слоновью версию участка геномной последовательности на мамонтовую.
В норме обрыв обеих нитей ДНК приводит к гибели клетки. Если же оборвалась только одна, ремонтные механизмы клетки могут восстановить любой недостающий участок, используя в качестве шаблона вторую нить. Если оборвались обе цепочки, не так очевидно, откуда клетка узнает, чем ей заменить утраченную последовательность.
Для решения этой проблемы в процессе эволюции возникло два механизма клеточной репарации. Первый называется гомологической рекомбинацией. Поскольку у каждой хромосомы в клетке существует гомологичная копия (одна хромосома от отца, другая – от матери), одну из них можно использовать в качестве шаблона для исправления ошибок в другой. При гомологической рекомбинации две гомологичные хромосомы выстраиваются друг напротив друга, позволяя механизмам клеточной репарации использовать генетическую последовательность неповрежденной хромосомы как образец для ремонта поврежденного участка. При вырезке и вставке мы пытаемся использовать этот механизм в своих целях. Одновременно мы хотим обмануть клетку, заставив ее вместо гомологичной хромосомы использовать в качестве шаблона синтезированный фрагмент ДНК (в нашем случае участок ДНК мамонта, доставленный в клетку вместе с молекулярными ножницами).
Второй механизм репарации двунитевых разрывов называется негомологичным соединением концов. Для работы этого механизма не требуется наличия гомологичной последовательности в качестве шаблона для репарации участка ДНК, вместо этого оборванные концы просто склеиваются между собой. Это не тот путь, по которому клетка должна пойти, если мы хотим изменить последовательность ДНК, но клетки часто используют такой механизм. Следовательно, одна из оставшихся трудностей заключается в том, чтобы разработать способ контролировать то, какой из механизмов будет задействован для репарации ДНК. Но пока что только часть отредактированных клеток получит новую версию гена, помещенную в нужное место в процессе репарации.
