Вскоре после появления в Мехико испанских конкистадоров во главе с Эрнандо Кортесом тогдашний теотиуаканский правитель Шиутотоцин, муж внучки Кецальмамаликцина, был отдан тескоканским правителем Какамой в качестве заложника испанцам и погиб во время их бегства из Теночтитлана в знаменитую «Ночь печали» (с 30 июня на 1 июля 1520 г.). Его сын Манауацин Тласольйаоцин поддержал тескоканского царевича Иштлильшочитля-младшего, непримиримого врага Какамы и ацтеков, вместе с которым в конце 1520 г. присоединился в качестве союзника к конкистадорам. Сменивший его в 1533 г. младший сводный брат крестился: крестным отцом был видный конкистадор Франсиско Вердуго, отчего новообращенный стал называться Франсиско Вердуго Кецальмамаликцин Уэцин. Он затем женился на дочери Иштлильшочитля-младшего, донье Ане Кортес Иштлильшочитль, благодаря чему его семья и потомство сохранили владения в Сан-Хуан-Теотиуакане (так стало называться поселение) в качестве подчинённых колониальным властям касиков.
По изготовленной местными мастерами масапанской карте XVI века видно, что на территории бывшего мегаполиса в то время располагались руины пирамид, поля кактусов нопаля, предположительно поле для игры в мяч, католические церкви и святилища, а также жилища испанцев и науа. По данным налоговых списков испанской администрации, население в долине Теотиуакана составляло около 26 тысяч человек. Немаловажную роль для жителей региона играло расположение Теотиуакана на пересечении торговых путей, в том числе ведущих в Мехико. В то же время, пагубные последствия конкисты и столкновения культур сказались на коренных жителях региона. Потеря земель, голод, болезни и прочие «прелести» колониального периода к 1570 году унесли жизни, по разным подсчётам, от 1/2 до 2/3 индейского населения. К 1620 г. эта цифра достигла 90%. Но ещё на протяжении последующих трёх столетий наследники династии теотиуаканских правителей играли здесь более-менее значимую роль. Правда, они в основном занимались защитой своих земель от посягательств церкви и дельцов, зато делали это в значительной степени успешно. Они продолжали вести ацтекскую практику брачных союзов с политически важными и могущественными семьями, занимались выращиванием пшеницы, магея15, ячменя и под конец начали сдавать землю в аренду испанцам. Ещё столетие после конкисты в сельской местности продолжали жить по старым традициям и в какой-то степени законам, а прежнее административно-территориальное деление и структура