Волоцкой удел принадлежал к Новгородской епархии. Архиепископом в Новгороде был тогда преемник Геннадия Серапион, бывший игумен Троице-Сергиевой Лавры. Иосиф обратился с челобитьем в Москву, не предупредив о том своего владыку, и, так сказать, самовольно исключил монастырь из его епархии, не взяв владычнего благословения. Он отговаривался после тем, что посланный им чернец не был пропущен за новгородский рубеж заставой, которая была временно учреждена по случаю свирепствовавшей в той земле моровой язвы (мор железою). Однако Серапион, напрасно прождав еще около двух лет какого-либо отзыва со стороны Иосифа, отважился на решительный шаг: он послал игумену неблагословенную грамоту, отлучающую его от священства и Св. Причастия. Такой поступок повлек за собой важные последствия. По жалобе Иосифа Серапион неволей привезен в Москву и предан суду духовного собора. Председателем на соборе был покровитель Иосифа митрополит Симон, а вторым после митрополита лицом тут заседал младший брат Волоцкого игумена Вассиан, незадолго возведенный в сан архиепископа Ростовского. Серапиона обвинили в неуважении к митрополиту и великому князю. В особую вину поставили ему следующее выражение его неблагословенной грамоты Иосифу: «что еси отказался от своего государя в великое государство… ино еси отступился от небеснаго, а пришел к земному». Конечно, это было написано в том смысле, что игумен променял Царство Небесное на земные блага, а его истолковали таким образом, что небесным тут назван князь Федор, а земным — сам. великий князь. На соборе Серапион утверждал, что он был прав, и давал иногда резкие ответы. Так, на вопрос своего явного неприятеля Вассиана, архиепископа Ростовского, на основании каких священных правил он отлучил и не благословил Иосифа, Серапион с запальчивостью отвечал: «Волен я в своем чернеце, а князь Федор волен в своем монастыре, хочет — жалует, хочет — грабит». По соборному определению, Иосиф был разрешен от владычнего запрещения и ему послано благословение священнодействовать. А Серапион лишен святительского мана и заключен в монастырь (сначала Андроников, йогом Троице-Сергиев). Но дело тем не кончилось.
Серапион написал оправдательное послание, обращенное к митрополиту и направленное против Иосифа. В 11овгороде он успел приобрести расположение граждан, и там о нем сожалели; в самой Москве многие приняли (то сторону и считали Волоцкого игумена неправым в этом деле. Так думали даже некоторые приверженцы последнего из среды бояр; они смущались помянутым его отлучением и высказывали желание, чтоб он просил прощения у своего бывшего владыки. Тогда Иосиф некоторым таким боярам (например, Ивану Ивановичу Третьякову-Ховрину и Борису Васильевичу Кутузову) написал пространные и энергичные послания, в которых вновь разбирал всю историю своего спора с архиепископом; обвинял его в гордости и непокорности высшим властям; доказывал, что Серапион неправильно отлучил его, не дав ему никакого суда, и что по правилам Св. Отец самый суд над священником должен совершаться вместе с другими епископами. Тут же Иосиф коснулся и вообще неприкосновенности монастырских имуществ. Этот вопрос затем он развил в особом сочинении