В 1846 году по проекту Пирогова в Медико-хирургической академии был создан первый в России анатомический институт, что позволило студентам и врачам заниматься прикладной анатомией, упражняться в производстве операций, а также вести экспериментальные наблюдения. Создание госпитальной хирургической клиники, анатомического института позволило Пирогову осуществить ряд важных исследований, определивших дальнейшие пути развития хирургии. Придавая особое значение знанию анатомии врачами, Пирогов в 1846 году опубликовал «Анатомические изображения человеческого тела, назначенные преимущественно для судебных врачей», а в 1850 году — «Анатомические изображения наружного вида и положения органов, заключающихся в трех главных полостях человеческого тела».
После смерти жены, Екатерины Дмитриевны Березиной, Пирогов дважды хотел жениться. По расчету. Не верил, что еще сможет полюбить. Жена, оставив Пирогову двоих сыновей, Николая и Владимира, умерла в январе 1846 года, двадцати четырех лет, от послеродовой болезни. В 1850 году Николай Иванович наконец-то влюбился и женился. Четыре месяца до брака он бомбардировал невесту письмами. Он отправлял их несколько раз на дню — три, десять, двадцать, сорок страниц мелкого убористого почерка! Он раскрывал невесте свою душу, свои мысли, взгляды, чувства. Не забывая и свои «худые стороны», «неровности характера», «слабости». Он не хотел, чтобы она любила его только за «великие дела». Он хотел, чтобы она любила его такого, какой он есть. Пока он готовился к свадьбе с девятнадцатилетней баронессой Александрой Антоновной Бистром, племянницей генеральши Козен, умерла его мать.
Известен метод Пирогова «ледяной скульптуры». Да простится автору эта улыбка: маньякам дальнейшее читать запрещается, дабы не стало руководством к действию. Поставив перед собой задачу — выяснить формы различных органов, их взаиморасположение, а также смещение и деформацию их под влиянием физиологических и патологических процессов, Пирогов разработал особые методы анатомического исследования на замороженном человеческом трупе. Последовательно удаляя долотом и молотком ткани, он оставлял интересовавший его орган или систему их. В других случаях специально сконструированной пилой Пирогов делал серийные распилы в поперечном, продольном и передне-заднем направлениях. В результате проведенных исследований им был создан атлас «Топографическая анатомия, иллюстрированная разрезами, проведенными через замороженное тело человека в трех направлениях», снабженный пояснительным текстом.
Указанный труд принес Пирогову мировую славу. В атласе было дано не только описание топографического соотношения отдельных органов и тканей в различных плоскостях, но и впервые показано значение экспериментальных исследований на трупе.
Работы Пирогова по хирургической анатомии и оперативной хирургии заложили научные основы для развития хирургии. Выдающийся хирург, обладавший блестящей техникой операций, Пирогов не ограничивался применением известных в то время хирургических доступов и приемов; он создал ряд новых методов операций, которые носят его имя. Предложенная им впервые в мировой практике костнопластическая ампутация стопы положила начало развитию костнопластической хирургии. Не остались без внимания Пирогова патологическая анатомия. Его известный труд «Патологическая анатомия азиатской холеры» (атлас 1849 г., текст 1850 г.), удостоенный Демидовской премии, и сейчас является непревзойденным исследованием.
Богатый личный опыт хирурга, полученный Пироговым во время войн на Кавказе и в Крыму, позволил ему впервые разработать четкую систему организации хирургической помощи раненым на войне.
Разработанная Пироговым операция резекции локтевого сустава способствовала в известной мере ограничению ампутаций. В «Началах общей военно-полевой хирургии…» (в 1864 г. опубл. на нем. яз.; в 1865–1866, в двух частях — на русск. Яз. (2-е изд), в двух частях в 1941–1944), которые являются обобщением военно-хирургической практики Пирогова, он изложил и принципиально разрешил основные вопросы военно-полевой хирургии (вопросы организации, учение о шоке, ранах, пиэмии и др.). Как клиницист Пирогов отличался исключительной наблюдательностью; его высказывания, касающиеся заражения раны, значения миазм, применения различных антисептических веществ при лечении ран (йодной настойки, раствора хлорной извести, азотнокислого серебра), являются по существу предвосхищением работ английского хирурга Дж. Листера.
