Хромосома В. anthracis включает 5,23 т. п. о. (штамм Ames), средний показатель Г+Ц составляет 35,4 %. По предварительным данным, хромосома содержит примерно 5750 генов со средней длиной около 710 нуклеотидов. Особенностью генома В. anthracis является наличие генов белков, для которых не были определены соответствующие фенотипы. Их функции включают гемолиз, подвижность и устойчивость к антибиотикам: пенициллину и тетрациклину. Основные гены вирулентности сибиреязвенного микроба локализуются на двух больших плазмидах: рХО1 (181 т. п. о.) и рХО2 (96 т. п. о.). Экзотоксин, состоящий из трех субъединиц — летального фактора, протективного антигена и фактора отека, обнаруживается в островке патогенности, расположенном на рХО1. Кластер генов, необходимый для биосинтеза другого фактора вирулентности — капсулы, расположен на рХО2 (Seshadri R. et al., 2005).
Возбудитель сибирской язвы относится к генетически гомогенным патогенным микроорганизмам (genetically homogeneous pathogens). R Keim et al. (2009) считают, что это вызвано короткой эволюционной историей микроорганизма, исключающей накопление мутационного полиморфизма и наличием спогювой фазы в его жизненном цикле. Большинство мутаций в генах любого вида образуются во время циклов репликации хромосомы. Спора же позволяет существовать В. anthracis годами, не вовлекаясь в процесс деления, необходимый для поддержания вегетативных клеток.
Для изучения молекулярной эпидемиологии возбудителя сибирской язвы используют два подхода: многолокусный анализ варьирующих по числу тандемных повторов (multiple locus VNTR analysis, MLVA) (Keim P. et al., 2060); и анализ полногеномного полиморфизма отдельных нуклеотидов (single nucleotide polymorphism, SNP, снипсы) (Van Ert M. N. et al., 2007).
MLVA-анализ штаммов В. anthracis. С конца 1990-х гг. спосоо популярен среди исследователей, занимающихся выявлением межштаммовых различий В. anthracis. Он основан на чежштаммовом статистическом анализе VNTR. Подробно способ описан в работах P. Keim et al. (2000) и К. L. Smith et al. (2002). VNTR представляют собой короткие нуклеотидные последовательности (12 п о.), образующие тандемы, ориентированные в одном направлении. VNTR встречаются в хромосомной и плазмидной ДНК В. anthracis и варьируют по длине у разных штаммов сибиреязвенного микроба (табл. 3.1).
Таблица 3.1. Характеристики маркерных локусов VNTR В. anthracis[1] | Размер по количеству повторов
Локуса | Размер повтора в нуклеотидахб | наименьший | наибольший | Количество аллелей | Индекс разнообразия (D)
vrrA | 12 | 2 | 6 | 5 | 0,50
vrrB1 | 9 | 15 | 23 | 5 | 0,32
vrrB2 | 9 | 11 | 15 | 3 | 0,34
vrrC1 | 36 | 4 | 12 | 6 | 0,55
vrrC2 | 18 | 17 | 19 | 3 | 0,50
CG3 | 5 | 1 | 2 | 2 | 0,35
pXO1-aat | 3 | 4 | 11 | 8 | 0,81
pXO2-at | 2 | 6 | 15 | 9 | 0,79
Avg | | | | 5,1 | 0,52
а — курсивом показаны маркеры, обнаруженные в ORP; б — vrrB-повторы не являются идентичными. Отдельные из них содержат множественные нуклеотидные различия; vrrC-маркеры содержат 9 вырожденных субповторяюгцихся структур; D — индекс разнообразия подсчитывается как 1—∑ (аллельная частота)2.
У В. anthracis от двух до шести копий VNTR расположены в пределах открытой рамки считывания гена, обозначенного как vrrA ^ variable region with repetitive sequence). Ген vrrA кодирует белок с ММ 30 кДа, гомологичный микрофилярному белку SHP2 оболочки паразитного червя Litomosoides carinii (Andersen G. L. et al., 1996). To, что ген эволюционно законсервирован среди бактерий, свидетельствует о функциональной активности кодируемого им белка, но эта функция не установлена (Jackson R J. et al., 1997). Ген vrrC кодирует полипептид ДНК-транслоказу (DNA translocase) и обычно содержит триплетный VNTR. Обнаруженный в хромосоме бактерии триплет VNTR указывает на локализацию в данном участке структурного гена (Keim R et al., 2009).
Такие локусы амлифицируют ся в ПЦР с использованием праймеров, комплементарных их фланкирующим последовательностям. Аллельные варианты VNTR-локусов хорошо разделяются в агарозном геле. Размер аллелей может быть установлен путем сопоставления со стандартными маркерами ММ. Их количественный анализ позволяет классифицировать различные штаммы В anthracis в зависимости от числа повторов и аллельных вариаций повторов. Сам факт присутствия VNTR-локусов в геноме разных видов бактерий, возможно, связан с тем, что ДНК-полимераза катализирует синтез нуклеиновой кислоты через короткий тандем повторяющихся последовательностей. Они и являются тем, что мы называем «VNTR» (Keim P. et al., 2009).
