Вечером 19 мая следственная комиссия прибыла в Углич и сразу приступила к допросам. Следствие продолжалось почти две недели. Похоронив тело царевича в угличской Спасской церкви, следователи 2 июня возвратились в Москву. Дьяк Василий Щелкалов зачитал материалы дела перед государем и собором во главе с патриархом Иовом. Из показаний опрошенных складывалась довольно ясная картина происшедшего.
Царевич Дмитрий страдал падучей (эпилепсией). Припадки болезни происходили бурно: во время одного из них он покусал руки дочери Андрея Александровича Нагого, дяди царицы Марии, а в другой раз изранил свайкой – длинным, толщиной в палец гвоздем, которым царевич любил играть в тычку, – саму царицу. Чтобы исцелить ребенка, его водили к кирилловским старцам причащаться богородичным хлебом; обращались и к знахарям, но они вместо лечения навели порчу на царевича. За три дня до несчастья у Дмитрия снова был припадок. В субботу 15 мая ему стало лучше, и царица повела его к обедне, а по возвращении во дворец разрешила ему поиграть на заднем дворе, поручив его попечению мамки Василисы Волоховой, кормилицы Арины Ждановой (по мужу Тучковой) и постельницы Марии Колобовой (по мужу Самойловой). К царевичу присоединились еще четверо «жильцов» – дворовых ребят-сверстников: Петрушка Колобов, Баженка Тучков, Ивашка Красенский и Гришка Козловский. Играли опять в тычку, попадая ножиком в железное кольцо, положенное на землю. Вдруг с царевичем случился новый припадок и, падая, он глубоко ранил себя ножем в шею.
«… На царевича пришла опять черная болезнь и бросило его об землю, и тут поколол царевич сам себя в горло и било его долго, да тут его не стало» (показания Василисы Волоховой).
«… набрушился сам на нож в падучей и был еще жив» (показания Григория Федоровича Нагого).
Арина Тучкова подхватила Дмитрия на руки. На крик из дворца выбежала царица. В гневе она принялась колотить поленом мамку, не уберегшую царевича, приговаривая, что сын ее Осип Волохов вместе с сыном Битяговского Данилой и его племянником Никитой Качаловым зарезали Дмитрия; а Волохова стала бить ей челом, чтобы велела царица дать сыск праведный, потому что сын ее Осип и на дворе не бывал.
Максимка Кузнецов, случайно бывший в это время на звоннице Спасской церкви, находившейся рядом со дворцом, заметил неладное и ударил в набат. Пономарь Соборной церкви вдовый поп Федот Афанасьев по прозвищу Огурец, услышав звон, побежал со двора в город; навстречу ему попался дворцовый стряпчий Кормового двора Суббота Протопопов, который, сославшись на приказ царицы, велел звонить в колокол, «да ударил его в шею».
В городе решили, что во дворце начался пожар. Народ повалил на дворцовый двор. Первыми прибежали братья царицы, Михаил и Григорий. Мария, устав избивать Волохову, но еще не утолив своего гнева, передала полено Григорию, который продолжил охаживать нерадивую мамку по бокам. Затем явился дядя царицы Андрей Александрович Нагой. Когда на дворе начала скапливаться толпа, он взял тело царевича, отнес его в церковь Спаса и был при нем «безотступно», «чтобы кто царевичева тела не украл». В это время Мария и Михаил стали возбуждать сбежавшийся народ, крича, что царевича зарезали Битяговские, отец и сын, Осип Волохов, Никита Качалов и дьяк Данила Третьяков. Другой дядя царицы Григорий Александрович Нагой, прибывший во дворец одним из последних, услышал уже, что «царевич, сказывают, зарезан, а того не видал, кто зарезал».
Дьяк Михаил Битяговский в это время обедал у себя дома вместе с попом Богданом, духовным отцом Григория Федоровича Нагого. Когда зазвонили в колокола, дьяк послал людей проведать, не пожар ли. Они вернулись, сказав, что сытник Кирилл Моховиков, назвавшись очевидцем несчастного случая, «подал весть», что царевич зарезался.
Битяговский бросился во дворец. Ворота были закрыты, но Кирилл Моховиков отпер их ему, подтвердив, что царевича не стало. По двору метались посадские люди с рогатинами, топорами, саблями. Битяговский побежал в покои царицы – «чаял того, что царевич наверху», но, не найдя никого, спустился вниз. Здесь его заметили дворовые и посадские люди и окружили. Он спросил их: для чего они с топорами и рогатинами? Вместо ответа они стали гоняться за ним и Данилой Третьяковым, который тоже оказался во дворе. Беглецы думали спастись, запершись в Брусяной избе, но толпа «высекла двери», выволокла дьяков из избы и убила обоих. Убили также человека, который выказал сочувствие к Волоховой.
Авдотья Битяговская показала, что велели убить ее мужа братья царицы, Михаил и Григорий, раздраженные постоянными ссорами с ним: Битяговский бранился с Михаилом Нагим за то, что тот «добывает беспрестанно ведунов и ведуний к царевичу Дмитрию» и что он с братом приютили ведуна Андрюшку Мочалова, который гадает им, сколь долговечны государь и государыня.
После убийства Михаила Битяговского с Данилой Третьяковым разделались с Данилой Битяговским и Никитой Качаловым, которые укрылись в Дьячной избе: они тоже были «выволочены» и «побиты до смерти». Затем начали грабить дворы убитых.