Поскольку Шире была еще недостаточно полноводной для обратного пути, Ливингстон решил использовать ближайшие месяцы для новой экспедиции на западный берег озера Ньяса. Оттуда он двинулся в глубь страны, так как услышал, что там находится много озер, из которых берут начало могучие реки. И действительно, плато к западу от Ньясы оказалось водоразделом. Вопрос, приведут ли реки, текущие на север, к Нилу или Конго, так и остался без ответа. Министерство иностранных дел недвусмысленно сообщило, что жалованье членам экспедиции будет выплачиваться только до конца 1863 года. В январе 1864 года Ливингстон на "Пионере" покинул Шире и в апреле - мае на собранной "Леди Ньяса" переправился из Занзибара в Бомбей.
Географические результаты экспедиции были велики. Ливингстон заснял непрослеженные им ранее участки течения Замбези и окончательно доказал, что это та самая река, которая в верховьях известна под названием Лиамбье. На карту были с достаточной точностью нанесены озеро Ньяса и река Шире, озеро Ширва, нижнее течение Рувумы.
В 1865 году Ливингстон выпустил книгу "Рассказ об экспедиции на Замбези и ее притоки и об открытии озер Ширва и Ньяса в 1858 - 1864 гг.". В Лондоне с удовольствием внимали его лекциям об уме и трудолюбии африканцев, бурными аплодисментами прерывали те места лекций, где речь шла о борьбе с работорговлей. Ливингстон был твердо уверен, что на смену охоте за рабами придет равноправная торговля и достойное человека существование. Однако средства для новой экспедиции ему пришлось искать самому.
Ливингстон продал "Леди Ньяса" и большую часть состояния потратил на оснащение новой экспедиции. Перед отъездом из Англии ему сообщили, что его сын Роберт погиб в Америке в войне между Северными и Южными штатами. В январе 1866 года, когда Ливингстон вновь ступил на африканскую землю, он выглядел человеком утомленным, разочарованным, ищущим уединения. Вопреки своим прежним привычкам он целый год. Не давал о себе знать, и уже в 1867 году его сочли пропавшим без вести.
Но ученый в это время с многочисленным караваном носильщиков (индийские и арабские купцы внесли свою долю в предприятие) уже побывал в долине реки Рувумы, обогнул с юга и запада озеро Ньяса, затем, взяв направление на северо-запад, переправился через две крупных реки: Лвангву и Чамбеши, разделенные горным кряжем Мучинга. Местные жители сказали ему, что Чамбеши вливается в
1 апреля 1867 года он достиг южного побережья Танганьики (местное название Льемба). Озеро длиной 650 километров с водой лазурного цвета является частью Центральноафриканского вулканического разлома, к которому относятся и озера Ньяса, Киву, Эдуард и Мобуту-Сесе-Секо. Экспедиция достигла его в том месте, где водную гладь окружают буйные леса, резко контрастирующие с серыми и красными песчаниковыми скалами. За озером на тогдашних картах Африки начинались обширные "белые пятна".
Весь переход от побережья до Танганьики был полон трудностей и неудач. Индийские солдаты-сипаи отказались идти в неизведанные глубины Африки, и Ливингстону пришлось отослать их обратно. В дальнейшем путь экспедиции проходил через малонаселенные районы, где было трудно достать продовольствие. Часть носильщиков сбежала, захватив с собой различное экспедиционное имущество, в том числе ящик с медикаментами, что было для путешественника настоящей катастрофой.
Ливингстон вынужден был прибегнуть к помощи арабо-суахильских торговцев невольниками и слоновой костью. Много лет Ливингстон болел малярией и к этому времени так ослабел и исхудал, что
8 ноября 1867 года Ливингстон открыл озеро Мверу с множеством островов, а 18 июля 1868 года к юго-западу от Танганьики - озеро Бангвеулу (Бангвеоло).
Он посетил северо-западные берега Бангвеулу и совершил небольшую поездку по нему на пироге, но осмотреть все озеро и составить правильное представление о его величине и очертаниях не смог: на его карте озеро имеет значительно большие размеры.
В феврале 1869 года Ливингстон вышел к озеру Танганьика, на этот раз ближе к его середине. Ровно месяц заняло плавание на лодках сперва вдоль западного берега Танганьики, а потом напрямик через озеро в Уджиджи. Там Ливингстона ждали письма и различные припасы, присланные ему с попутными караванами из Занзибара. Правда, большая часть адресованных ему грузов застряла по дороге или была разворована.