Тяжелая ситуация, в которой оказался Орден родосских рыцарей, разумеется, не была секретом для турок. Они решили воспользоваться представившейся им возможностью и напасть на Родос, коль скоро он оказался в одиночестве, лишенным всякой помощи со стороны. Сведения, поступавшие к Великому Магистру, были самыми неутешительными. В конце 1521 г. Марко Минио, венецианский посланник при дворе падишаха в Константинополе, докладывал о крупномасштабных военных приготовлениях турок. На султанских верфях ремонтировались и строились новые военные корабли, нанимались матросы и солдаты. Согласно предположениям одних информаторов, турецкий флот должен был напасть на Кипр, согласно предположениям других – на о. Керкиру (Корфу), или даже на Италию. Мало кто говорил об опасности, могущей угрожать Родосу. Тем не менее, беспокойство иоаннитов все возрастало, и они принимали все новые меры к укреплению обороны острова. Родосцы углубляли рвы, наращивали крепостные стены и конкретизировали планы на случай осады, определяя пост на стене для каждого бойца каждого орденского «языка». По мнению многих историков, главная крепость Родоса была на тот момент самой современной и неприступной из всех, существовавших на тот момента в Западном мире. Гарнизон острова состоял из 300 рыцарей Ордена Святого Иоанна Иерусалимского, 7500 итальянских наемных воинов и моряков, критских лучников (известных своей меткостью еще с античных времен) и родосских ополченцев. Специальным комитетам при важнейших должностных лицах Ордена были поручены организация снабжения съестными припасами и военными материалами и надзор над соответствующими работами.
26 июня 1522 г. на о. Родос высадилось турецкое войско. Верховным главнокомандующим турок был Мустафа Паша, зять султана и второй визирь. Его сопровождал и первый (Великий) Визирь, Пири Мехмет Паша. Под стенами г. Родоса снова засверкали турецкие бунчуки, увенчанные серебряными полумесяцами. Сухопутные силы турок состояли из 100 000 бойцов, включая 10 000 янычар и более 60 000 саперов, специально обученных искусству минных работ и разрушения фортификационных сооружений. На первом этапе осады Родос был блокирован с моря 280 турецкими кораблями разной величины. По мере продвижения турецких осадных работ, количество османских кораблей постепенно увеличилось до 400. Гарнизон г. Родоса состоял из 290 рыцарей Ордена Святого Иоанна и (по разным источникам) от 6000 до 7500 сержантов и наемных солдат. Сельское греческое население, для которого не нашлось место в орденских крепостях Линдос, Фараклос и Монолитос, с семьями и домашней скотиной укрылось за стенами Родоса. Во время осады крестьяне-греки привлекались иоаннитами к вспомогательным работам.
По сравнению с осадой 1480 г. турки изменили свою тактику. Теперь их главные удары были направлены на орденские укрепления не со стороны моря, значительно усиленные родосскими рыцарями за прошедшие со времен прежней осады десятилетия, а со стороны суши. Со стороны моря османы ограничились блокадой обоих орденских портов силами своего гигантского флота.
Турецкая тяжелая осадная артиллерия подвергла жесточайшей бомбардировке крепостные бастионы, оборонявшиеся иоаннитами «языков» Испании, Англии и Прованса. В промежутках между обстрелами турецкие сухопутные силы нескончаемыми волнами атаковал город. Но рыцарям Родоса удавалось отбивать один турецкий приступ за другим. Турки несли огромные потери от смертоносного артиллерийского и аркебузного огня защитников города и в рукопашных боях с гарнизоном Родоса, совершавшим постоянные вылазки. Турецкое войско, славившееся до сих пор своей высокой боеспособностью и образцовой воинской дисциплиной, стало проявлять первые признаки упадка боевого духа и разложения.
С учетом сложившегося положения, первый Визирь, Пири Мехмет Паша, отправил султану донесение об обстановке с настоятельной просьбой ускорить свое личное прибытие в лагерь осаждающих. 28 июля Сулейман высадился на острове во главе дополнительного стотысячного турецкого контингента, что подняло боевой дух турецкого воинства. Бои шли днем и ночью, обе стороны сражались, проявляя чудеса воинской доблести. В ходе второй осады Родоса важнейшую роль играли артиллерия и минные работы. Турки постоянно рыли подкопы с целью проникновения в осажденный город или же подрыва стен, расчистив тем самым путь в город колоннам штурмующих. Однако иоаннитам почти во всех случаях удавалось при помощи контрмин срывать турецкие попытки.
