Ваниль дает множество мелких семян, которые не прорастают в естественных условиях. Для успешного проращивания семян можно использовать технику культивирования тканей. Протоколы для выращивания семян и зародышей ванили стандартизированы (Gu et al., 1987; Knudson, 1950; Minoo et al., 1997; Withner, 1955).
Посев семян на различных базальных средах показал, что семена ванили не имеют строгих требований к питанию для начала прорастания, в отличие от некоторых наземных орхидей умеренного климата (Minoo et al., 1997). Прорастание семян начинается в течение четырех недель после культивирования, и начальные стадии прорастания типичны для большинства орхидей, такие как набухание зародыша с последующим разрывом семенной оболочки и последующее появление протокорма (рис. 5.3). Семена прорастали непосредственно в проростки в среде, дополненной одним бензиладенином (БА) (0,5 мг/л), без какой-либо промежуточной фазы каллуса, и, таким образом, их можно было использовать для получения самоопыленных потомков/проростков. Добавление триптона имело стимулирующий рост эффект на размер и развитие протокорма, независимо от базовой среды, в которую он был добавлен. При обработке БА большинство протокормов оставались такими же, с чешуевидными примордиальными листьями и развивающимися в побеги, тогда как обработка добавками ауксина показала постепенную дезорганизацию протокорма в каллус. Среда Мурасиге и Скуга (МС), для культур ванили in vitro, давала лучший отклик, чем среда Кнудсона. Минимальная всхожесть (26%) наблюдалась в среде МС при половинной концентрации, а максимальная (85%) была зарегистрирована в среде МС полной концентрации с добавлением 2 г/л триптона (Minoo, 2002).
РИСУНОК 5.3. Прорастание семян in vitro.
Считается, что потребность в цитокинине для прорастания связана с использованием липидов, которые составляют основной запасной материал в большинстве семян орхидей, и было замечено, что, если запасной липид не используется, прорастание не продолжается (De Pauw et al., 1995).
Известно, что ваниль, культура с перекрестным опылением, имеет множество мейотических и постмейотических хромосомных аномалий (Ravindran, 1979). В результате можно получить различные цитотипы в семенном потомстве. Таким образом, выращивание из семян может дать множество генетически разнообразных типов. Исследования прорастания семян ванили и полученного в результате потомства in vitro показали морфологические и биохимические вариации. На самоплодных потомках V. planifolia были изучены профили изоферментов супероксиддисмутазы (SOD) и пероксидазы (PRX). Профили четко указывают на различия между потомками, выраженные наличием или отсутствием конкретных полос. Максимальное сходство, которое продемонстрировали эти потомки, составило 47,37%, что указывает на высокую сегрегацию и уровень гетерозиготности, существующие у V. planifolia (Minoo et al., 1997). Эта гетерозиготность была дополнительно подтверждена анализом AFLP (Bory et al., 2008c). Поэтому, культуру in vitro можно использовать для проращивания семян и отбора полезных генотипов из сегрегированных потомков, которые можно было бы массово размножать для получения свободного от болезней посадочного материала.
<p>Микроразмножение</p>Размножение ванили in vitro необходимо для получения однородных, свободных от болезней ростков и сохранения генетических ресурсов. Размножение in vitro с использованием апикальной меристемы стандартизовано для крупномасштабного размножения здоровых и генетически стабильных растений (Cervera and Madrigal, 1981; George and Ravishankar, 1997; Kononowicz and Janick, 1984; Minoo, 2002; Minoo et al., 1997; Philip and Nainar, 1986; Rao et al., 1993b). Стандартизовано in vitro размножение V. tahitensis (Mathew et al., 2000) и исчезающих видов ванили, таких как V. wightiana, V. andamanica, V. aphylla и V. pilifera (Minoo et al., 2006b), чтобы защитить эти виды от исчезновения.
Сообщалось о методах клонального размножения для эффективного размножения V. planifolia путем индукции множественных побегов из эксплантатов пазушных зачатков (рис. 5.4) с использованием полутвердой среды МС с добавлением БА (2 мг/л) и α-нафталинуксусной кислоты (НУК, 1 мг/л) (George and Ravishankar, 1997). Множественные побеги переносили в перемешиваемую жидкую среду МС с БА в концентрации 1 мг/л и НУК в концентрации 0,5 мг/л в течение 2–3 недель, а затем культивировали на полутвердой среде. Используя этот метод, в среднем от одного эксплантата пазушной почки было получено 42 побега в течение 134 дней. Было обнаружено, что использование промежуточной жидкой среды способствует увеличению количества побегов.
РИСУНОК 5.4. Микроразмножение V. planifolia.
