Первые шаги в музыке Н. Лысенко делает как пианист — сначала в киевских пансионах Гедуэна и Вейля, где учится у чехов К. Нейнкивча и чрезвычайно популярного киевского педагога и исполнителя Паноччини (Алоизия Поноцного). Далее — в харьковской 2-й гимназии — его учителями становятся Й. Вильчек и известный русский пианист и композитор Николай Дмитриев. В Харькове юный Лысенко начинает даже концертировать в камерных собраниях (и как солист, и в ансамбле с преподавателями и соучениками) в доме попечителя Харьковского учебного округа Федора Голицына. Концертную деятельность как пианист Н. В. Лысенко будет вести, таким образом, с 14–15 лет до конца жизни: около 55-ти лет.
В 1860 г. Н. Лысенко поступает на факультет естественных наук Харьковского университета, где уже учился М. Старицкий. Со следующего учебного года они вынуждены, во избежание репрессий после студенческих волнений в Харькове, перевестись в Киевский университет. Здесь юноши попадают в круг прогрессивного студенчества, которое составляло так называемую Киевскую «Старую громаду». Происходит знакомство Н. Лысенко с Тадеем Рыльским, Борисом Познанским, Петром Косачем, Михаилом Драгомановым и его сестрой Ольгой, Владимиром Антоновичем, Павлом Житецким и многими другими, чье самоотверженное служение национальной идее определило политическое и культурное развитие Украины во второй половине XIX — начале XX в.
В Киеве Лысенко продолжает интенсивно заниматься музыкой. Под влиянием программы, намеченной «Старой громадой», начинает собирать и обрабатывать народные песни, работает над «Словарем украинского языка» и переводами общедоступных учебников, создает студенческий хор Киевского университета (существует с 1864 г. и до сих пор), который начинает исполнять народные песни в его обработках; принимает участие в студенческих спектаклях, создав, в частности, в 1864 г. музыкальное сопровождение к водевилю В. Гоголя (отца) «Простак».
Вместе со Старицким делают они в 1863 г. первую попытку написать оперу — народную музыкальную драму «Гаркуша» на сюжет повести Олексы Стороженко.
В то же время Лысенко выступает как пианист в концертах в пользу создаваемого в то время Киевского отделения Русского музыкального общества, исполняя с большим успехом не только исключительно сложные сольные произведения, но и 2-й концерт Ф. Шопена и прочие произведения для фортепиано с оркестром; участвует в хоре РМО при первой постановке в Киеве фрагментов оперы М. Глинки «Иван Сусанин».
Поэтому не удивительно, что, с блеском окончив университет и защитив в 1865 г. кандидатскую диссертацию, Николай Лысенко все же выбирает музыку и едет в 1867 г. в Лейпцигскую консерваторию. Поступив туда как пианист, он одновременно слушает лекции по теоретическим дисциплинам и композиции у ведущих немецких профессоров. Ограниченность финансовых возможностей (после отмены крепостного права Лысенко оказались в затруднительном положении, и Николая даже исключали из университета из-за неуплату за обучение на втором курсе) заставляет его постичь консерваторский курс за два года. Н. Лысенко становится первым в Украине и одним из немногих среди своего поколения композиторов Российской империи, кто имел европейское профессиональное образование.
В Лейпциге Лысенко издает свои первые произведения — фортепьянную «Сюиту на темы народных песен в форме старинных танцев», первые два «Сборника обработок украинских народных песен для голоса в сопровождении фортепиано». За свою жизнь он издаст 7 таких сборников по 40 песен, 12 «Хоровых десятков» (обработок для хора); обрядовые сборники: «Коломыйки», «Колядки, щедривки», два «Венка веснянок», «Свадьба», «Купальська справа», всего свыше 500 обработок для голоса и хоров; два специальных сборника для молодежи — «Молодощи» и «Сборник украинских народных песен в хоровом раскладе, приспособленных для учеников младшего и подстаршего возраста в школах народных».
Тогда же в Лейпциге издает композитор и первый выпуск «Музыки Николая Лысенко к „Кобзарю“ Тараса Шевченко». Это одна из вершин его творчества. Иван Франко писал: «Между собственными композициями Лысенко, среди его опер и оперетт, лучшие и самые талантливые его композиции ко многим поэзиям Шевченко, в которых музыкальность стиха он ощутил глубже, и сумел отразить ее лучше всех других многочисленных композиторов, которых манила к себе муза Шевченко». А выдающийся западноукраинский композитор XX в. Станислав Людкевич называл эти произведения «правдивыми жемчугами насквозь оригинального лысенковского творчества».
