Сменивший Святителя Геннадия архиепископ Новгородский Серапион был более склонен потакать тайным недругам Иосифа, и вообще отличался крутым нравом. Мало того, что князь Феодор Борисович подкупил Серапионовых чиновников, сам владыка взъярился на Преподобного за его якобы непослушание. Передача богатейшего Волоцкого монастыря из удела во владение державного и, стало быть, под омофор Московского митрополита, означала для Серапиона утрату важнейшего источника доходов. Благословлять такое правящий архиерей не собирался. Тем не менее, Иосиф посылал к нему за благословением. Только гонца задержали в Торжке. Шла моровая язва, на дорогах стояла карантинная стража. Посланец опоздал. А великий князь с митрополитом Симоном не собирались ждать. Они и без благословения Серапиона сами решили вопрос о передаче монастыря. Возможно, полагает ряд исследователей, они это сделали умышленно, дабы лишний раз утвердить непререкаемость верховной власти. Да не таков был архиепископ Серапион. Во гневе он обрушился на Иосифа, обвинил его в самочинии, отлучил его от причастия и отстранил от богослужения. При этом сам Серапион нарушил устав Церкви, ибо запретил игумена без согласия митрополита, чем прогневал Симона и, главное, великого князя Василия III.
Соблюдая наложенный на него запрет, Иосиф не дерзал ослушаться. Он не служил, не причащался, пока не получил разрешительной грамоты от митрополита. Серапиона же тем временем вызвали в Москву и за его собственное самовольство отлучили Собором епископов.
С канонической точки зрения всё исполнили точно, хотя по сути, может быть, и не милосердно. Власть центральная утвердила себя, явно унизив епархиального архиерея. Впрочем, и того тоже по-иному было не унять. На вопрос митрополита, почему он наказал Иосифа, не разобравшись в деталях дела, Серапион заносчиво ответил:
И.Хрущёв, завершая свою книгу о Волоцком, говорит: «Церковь, осенившая венцом святости Иосифа, Серапиона и Максима Грека, как бы примирила разногласия». Только сие пресловутое
По Хрущёву, когда Серапион отлучил Иосифа, тот, «несмотря на то, что был тяжело болен - не дерзнул причащаться... он [Иосиф] сам считал себя связанным, хотя и был отлучён неправильно, и к тому же одним архиепископом; между тем как Серапион, отлучённый на основании священных правил, целым собором святителей, не считает себя связанным». Потому-то, собственно, Иосиф и не просил у него прощения, как у епископа, бывшего в запрещении, но не желавшего каяться. И потом, когда подстрекаемые Вассианом «Заволжские иноки» начали писать в осуждение Иосифа, что тот, мол, не чтит своего владыку (отлучённого Серапиона), Волоцкие старцы им напомнили о почтении к освященному Собору архиереев. «Ты говоришь, - пишет Иосифов постриженник Нил Полев "заволжцу" Герману, - о врагах и отступниках правой веры, что не следует ни осуждать их, ни посылать в заточение, а только молиться за них - сам же осуждаешь митрополита». Из таких вот взаимных укорений и увещеваний в письмах и сложились так называемые «нелюбки» Волоцких и Заволжских старцев. А в Москве князь-инок Вассиан развернул бурную кампанию в защиту Серапиона. Из заточения старца не выпустили, но митрополит Симон и Василий III всё же попросили у него прощения.