Вполне вероятно, что усилия католиков подчинить западно-русскую церковь папе привели бы к навязыванию церковной унии гораздо раньше, чем это произошло на самом деле. Но случилось так, что в середине XVI века власть католической церкви над Польшей и ВКЛ на некоторое время ослабла под напором быстрого распространения протестантизма. Протестантские течения впервые проникли на эти земли из Чехии еще до начала Реформации Лютера в Германии, в основном через евангелическую общину «чешских братьев». Но следом пришли уже идеи немецкой Реформации. Этому здорово способствовало то, что многие польские и литовские дворяне посылали своих сыновей на обучение в немецкие школы и университеты, а сами студиозусы жадно внимали новым веяниям. Другой причиной стала секуляризация Тевтонского ордена в Пруссии (1525) и его «филиала» в Ливонии. Во всяком случае, когда прежний великий магистр Альбрехт отказался подчиняться папе и стал светским герцогом Пруссии, он одновременно превратился в вассала польского короля.
В результате после 1550 года вельможи ВКЛ массово увлеклись кальвинизмом. Во многом по примеру могущественного государственного деятеля княжества Николая Радзивилла Чёрного, который в 1553 году отрекся от католицизма и принял кальвинизм, после чего чрезвычайно активно участвовали в кальвинистском движении. Его примеру последовали многие другие магнаты и шляхтичи, что придало кальвинизму значительный вес в среде панов-рады. В 1564 году кальвинистом стал еще один известный Радзивилл — Николай Рудый (Рыжий), первоначально тоже католик. Примерно в то же время отрекся от православия и принял кальвинизм Ян Иеронимович Ходкевич, а из других князей русского происхождения в кальвинизм был обращен Семен Пронский (выходец из рязанской ветви Рюриковичей), изменивший свое имя на Фредерик. Основным проводником протестантизма в форме социнианства был еще один магнат ВКЛ белорусского происхождения — Ян Кишка.
Пользуясь патронажем вельмож, протестанты Великого княжества Литовского стали открывать много церквей и молельных домов, основывать школы, издавать книги. Примечательно, что первой книгой, выпущенной на литовском языке, был перевод «Катехизиса» Мартина Лютера (изданный в Кенигсберге в 1547 г.). Николай Чёрный содействовал переводу на русский язык кальвинистского катехизиса Сымона Будного, который был издан в 1562 году в Несвиже под названием «Катехизис для простых людей языка русского». Он же субсидировал издание польского перевода Библии, подготовленного социнианами (Брест, 1563 г.), а девять лет спустя польского перевода Библии, выполненного Сымоном Будным, тоже вышедшей в Несвиже. Протестанты открыли несколько средних и начальных школ, к примеру, в Новогрудке, Несвиже, Ковно и Витебске. Среди социнианских учебных заведений была средняя школа, открытая братьями Гойскими в Гоще (Волынь). Именно в этой школе в 1602–1603 годах изучал латынь Лжедмитрий I.
В 1500 году в ВКЛ насчитывалось 700 римско-католических приходов, тогда как в 1566 году, по утверждению иезуита Циховиуса, в лоне римско-католической церкви оставалась лишь одна тысячная доля прежних прихожан. Скорее всего, это риторическое преувеличение, хотя и подкрепленное фактами. Например, на всю Жемайтию в этом году осталось только шесть католических священников. Между тем после полного обращения римско-католических прихожан в протестантство те обычно превращали католические храмы в свои молельные дома, выкидывая прочь статуи святых и иконы, а иногда даже разрушая церковные здания.
Протестантство распространялось и среди православных. Считается, что только в Новогрудском повете было приспособлено под протестантские молельные дома или разрушено 650 православных церквей, а из 600 православных дворянских семей, проживающих в этом регионе, верность православию сохранили лишь 16. Территория массового распространения протестантизма в Великом княжестве Литовском включала в себя собственно Литву и Жемайтию, Новогрудско-Литовскую область, Волынь, а также города Брест, Заславль (у Минска), Полоцк и Витебск. Статистических данных о числе людей «русской веры», ставших протестантами в ВКЛ, нет. Несомненно, однако, что наибольший процент обращенных приходился на аристократию и шляхту, прежде всего молодое поколение Ходкевичей, Воловичей, Сапегов, Вишневецких и многих других магнатских родов. Причем в таких городах, как Полоцк и Витебск, протестанты составляли, по-видимому, меньшинство населения.
