Главным научным трудом Афанасьева стали «Поэтические воззрения славян на природу» в 3 томах (1865–1869), где он соединил и привел в стройную систему все написанное им прежде и все наиболее важное из трудов западных ученых-мифологов. Для своего времени это был фундаментальный научный труд, посвященный историко-филологическому анализу языка и фольклора славян в связи с языком и фольклором других индоевропейских народов, опираясь при этом на труды европейских ученых мифологической школы и Федора Ивановича Буслаева. Афанасьев также пытался реконструировать утраченные древнейшие поверья и обычаи славян. Ученый пришел к выводу, что «духовная сторона человека, мир его убеждений и верований, в глубокой древности не были вполне свободным делом, а неизбежно подчинялись материальным условиям, лежавшим столько же в природе окружающих его предметов и явлений, сколько и в звуках родного языка. Слово человеческое, по мнению наших предков, наделено было властительною, чародейною и творческою силою; и предки были правы, признавая за ним такое могущество, хотя и не понимали, в чем именно проявляется эта сила. Слово, конечно, не может заставить светить солнце или падать дождь, как верили язычники; но если не внешнею природою, зато оно овладело внутренним миром человека и там заявило свое чарующее влияние, создавая небывалые отношения и образы и заставляя младенческие племена на них основывать свои нравственные и религиозные убеждения. Часто из одного метафорического выражения, как из зерна, возникает целый ряд примет, верований и обрядов, опутывающих жизнь человеческую тяжелыми цепями, и много-много нужно было усилий, смелости, энергии, чтобы разорвать эту невидимую сеть предрассудков и взглянуть на божий мир светлыми очами!» В то же время в своей книге Афанасьев, не будучи лингвистом, порой слишком доверял «народной этимологии».
Наиболее известным фольклорным сборником Афанасьева стал сборник «Народные русские сказки», опубликованный в 1855–1863 годах в 8 выпусках. Второе, переработанное издание в 4 томах, подготовленное Афанасьевым, было опубликовано в 1873 году уже посмертно. В нем сказки были разделены по тематическим разделам (сказки о животных, волшебные, новеллистические, бытовые сатирические сказки, анекдоты), научные примечания составили четвертый том, куда вошли также лубочные сказки. Всего в сборнике насчитывалось 579 сказок, причем часть из них была на белорусском и малороссийском наречиях. Еще три сказки не были пропущены цензурой.
В 1870 году Афанасьев также издал «Русские детские сказки» для семейного чтения, отобранные из основного собрания. В этот сборник вошла 61 сказка: 29 сказок о животных, 16 волшебных и 16 бытовых сказок. Уже после публикации сборника глава цензурного комитета и член совета Министерства внутренних дел Платон Алексеевич Вакар в представлении в ведомство печати поставил на вид, что следует уведомить все ведомства, имеющие учебные заведения, о том, что содержание 24 сказок является неприемлемым и вредным: «Чего только не изображается в них, не говоря уже о главной основной идее почти всех этих сказок, то есть торжества хитрости, направленной к достижению какой-либо своекорыстной цели, в некоторых проводятся олицетворенные возмутительные идеи, как, например, в сказке «Правда и кривда», в которой доказывается, что «правдою на свете мудрено жить, какая нынче правда! За правду в Сибирь угодишь…». Следующее издание детских сказок вышло только в 1886 году. Система, принятая Афанасьевым, стала первой в истории попыткой классификации сказок. На материале 100 сказок из сборника Афанасьева Владимир Яковлевич Пропп выделил структуру волшебной сказки в книге «Морфология сказки» (1928). Сборник «Русские народные сказки» положил начало научному собиранию и изучению восточнославянской сказки. За его научный подвиг Афанасьева по праву называли «русским Гриммом».
Наряду со сказками Афанасьев собирал произведения и других жанров фольклора, в том числе песни, пословицы и притчи. Песни, преимущественно записанные им самим в Московской и Воронежской губерниях, он передал Павлу Васильевичу Шейну, и они были напечатаны в его сборнике «Русские народные былины и песни» (1859). А около 500 пословиц и притч были опубликованы в одной из книг «Архива историко-юридических сведений о России» за 1876 год.
