В ноябре 1800 года Александр и Эме выехали на остров Куба и провели несколько месяцев в Гаване, совершая вылазки в различные районы Кубы, изучая природу и политическое устройство Антильских островов. Затем путешественники переправились в Бразилию, поднялись по реке Магдалене до Онды, откуда проехали в Боготу. Архиепископ предоставил гостям экипажи, знатнейшие лица города с восторгом встречали путешественников. Конечно, в столь теплом приеме сыграла свою роль и благосклонность испанского правительства, оказанная Гумбольдту.
Посвятив довольно много времени изучению плато Санта-Фе, путешественники отправились в Кито через проход Квиндиу в Кордильерах. Это был опасный и утомительный переход: пешком, по узким ущельям, под проливным дождем, без обуви, которая быстро износилась и развалилась. Приходилось ночевать в мокрой одежде под открытым небом, брести, утопая в грязи, карабкаться по узким тропинкам... На пути и в провинции Кито они исследовали вулканы Экваториальных Анд, в июне поднимались на потухший вулкан Чимборасо (6267 метров) и достигли высоты 5760 метров - мировой рекорд того времени, затем путешествовали в Перуанских Андах и в октябре прибыли в Лиму. В январе 1802 года путешественники достигли города Кито. В благодатном климате Перу они провели около года. Гумбольдт и Бонплан изучали богатую природу этой части Америки. Гумбольдт поднимался на вулканы Пичинчу, Котопахи, Антизану и другие.
В декабре 1802-го - марте 1803 года исследователи перешли морем через Гуаякиль к порту Акапулько и через три недели были в городе Мехико. Там они прожили до января 1804 года, совершая недалекие экскурсии по стране. Гумбольдт продолжал изучение вулканов.
9 июля 1804 года, после почти пятилетнего пребывания в Америке, Гумбольдт и Бонплан отплыли в Европу и 3 августа того же года высадились в Бордо.
Это было одно из величайших по научным результатам путешествий, хотя Гумбольдт и Бонплан не сделали никаких территориальных географических открытий. Метод географических исследований Гумбольдта стал образцом для научных экспедиций XIX века. До этой экспедиции только один пункт внутри Южной Америки - Кито - был точно определен астрономически; геологическое строение ее было вовсе неизвестно. Гумбольдт определил геологическое положение различных пунктов, произвел около 700 измерений высот, то есть создал географию и орографию местности, исследовал ее геологию, собрал сведения о климате страны. Гербарий состоял из 6000 экземпляров растений, в том числе около 3000 неизвестных раньше видов. Были исправлены и дополнены карты течения Ориноко и Амазонки; определено направление некоторых горных цепей и открыты новые (например, Анды Паримы), выяснено распределение гор и низменностей; нанесено на карту морское течение вдоль западных берегов Америки, названное Гумбольдтовым. Он изучал деятельность вулканов - в том числе знаменитого Иорульо, образовавшегося в 1755 году, произвел многочисленные барометрические измерения, исследовал пирамиды и храмы древних обитателей Мексики - ацтеков и тольтеков, изучал историю и политическое состояние страны.
Один из создателей физической географии как науки, Гумбольдт, описывая посещенные им страны, дал образцы научного страноведения. Он теоретически обобщил наблюдения и удачно пытался установить взаимную связь различных географических явлений и их распределение на Земле. Он стал одним из основоположников современной географии растений, выдающимся историком географических открытий, климатологом, океанографом, картографом и магнитологом.
В Париже он был встречен в ученых кругах с восторгом. Только Наполеон Бонапарт принял его холодно и ограничился пренебрежительным замечанием:
Гумбольдт в течение двадцати лет обрабатывал в Париже вместе с французскими учеными собранные им и Бонпланом огромные материалы: итогом стал незаконченный труд ""Путешествие в равноденственные области Нового Света" (30 томов, 1807-1834 годы). Издание содержит 1425 таблиц, в том числе цветных. А в 1808 году вышли написанные в популярной форме "Картины природы", переведенные на все европейские языки.
В 1805 году он отправился в Италию, к брату, которому передал материалы для изучения американских наречий, собранные во время путешествия; затем посетил Неаполь, где наблюдал извержение Везувия. В этой экскурсии его сопровождали физик Гей-Люссак и геолог Леопольд фон Бух.
