Тем не менее среди знати лавинообразно ширится стремление бежать от царя Ивана за границу, прежде всего в Великое княжество Литовское. Дважды пытался сделать это и дважды был прощен И.Д. Бельский. Были пойманы при попытке к бегству и на первый раз прощены князь В.М. Глинский и И.В. Шереметев. Зимой 1563 года в ВКЛ перебежали бояре Колычев, Пухов-Тетерин и Сарохозин. За попытку уйти туда же смоленского воеводу князя Дмитрия Курлятево сослали в отдаленный монастырь на Ладожском озере. Опасаясь опалы, в апреле 1564 года в ВКЛ перебежал Андрей Курбский. А в 1564 году московское войско было разбито на реке Уле, что послужило толчком к началу уже реальных казней тех, кого Иван Грозный счел виновниками поражения: были казнены двоюродные братья — князья Оболенские, Михайло Петрович Репнин и Юрий Иванович Кашин. Считается, что Кашина казнили за отказ плясать на царском пиру в скоморошьей маске, а Дмитрия Фёдоровича Оболенского-Овчину — за то, что он попрекнул Фёдора Басманова в гомосексуальной связи с царем. За ссору с Басмановым был казнен и известный воевода Никита Васильевич Шереметев. Короче, процесс репрессий пошел активно, а в 1565 году Грозный вообще объявил о введении опричнины.
Согласно его указу Московское царство делилось на две части: «Государеву светлость опричнину» и земство. В опричнину попали преимущественно северо-восточные земли Московии, где было мало бояр-вотчинников, ради ликвидации которых этот институт, собственно, и вводился. Центром опричнины стала Александровская слобода. А ее первыми жертвами — главный воевода в Казанском походе А.Б. Горбатый-Шуйский с сыном Петром, его шурин Пётр Ховрин, окольничий П. Головин (чей род традиционно занимал должности московских казначеев), П.И. Горенский-Оболенский (его младший брат Юрий успел спастись в Литве), князь Дмитрий Шевырёв, С. Лобан-Ростовский и др.
Началом образования опричного войска тоже считается 1565 год, когда был сформирован отряд в 1000 человек, отобранных из опричных уездов. Каждый опричник приносил клятву на верность царю и обязывался не общаться с земскими людьми. В дальнейшем число опричников достигло 6000 человек. В опричное войско включались также отряды стрельцов с опричных территорий. С этого времени служилые люди стали делиться на две категории: дети боярские, из земщины, и дети боярские, «дворовые и городовые», то есть получавшие государево жалованье непосредственно с «царского двора». Следовательно, опричным войском надо считать не только государев полк, но и служилых людей, набранных с опричных территорий и служивших под начальством опричных («дворовых») воевод и голов. Введение опричнины ознаменовалось массовыми репрессиями: казнями, конфискациями, опалами. С помощью опричников, которые были освобождены от судебной ответственности, Иоанн IV насильственно конфисковывал боярские и княжеские вотчины, передавая их дворянам-опричникам. Самим боярам и князьям предоставлялись поместья в других областях страны, например в Поволжье, причем далеко не всем. Напротив Кремля на Неглинной (территория нынешней РГБ) был построен каменный Опричный двор, куда переселился из Кремля царь.
В начале сентября 1567 года Грозный вызвал к себе английского посланника Дженкинсона и через него передал королеве Елизавете I просьбу о предоставлении убежища в Англии. Это было связано с известием о заговоре в земщине против него. По этому делу последовал ряд казней, а конюший боярин Иван Фёдоров-Челяднин, крайне популярный в народе своей неподкупностью и судейской добросовестностью, был сослан в Коломну. Вскоре его обвинили в том, что с помощью слуг он якобы собирался свергнуть царя. Фёдоров-Челяднин и еще 30 человек, признанные его сообщниками, были казнены, их поместья разгромлены, а все слуги перебиты. В целом, однако, репрессии носили беспорядочный характер. Хватали без разбора друзей и знакомых Челяднина, уцелевших сторонников Адашева, родню находившихся в эмиграции дворян и т. д. Побивали всех, кто осмеливался протестовать против опричнины. В подавляющем большинстве случаев казнили даже без видимости суда, по доносам и оговорам под пыткой. Как утверждают, Федорову-Челядину, например, царь собственноручно нанес удар ножом, после чего его изрезали опричники. В 1569 году Грозный покончил со своим двоюродным братом князем Владимиром Андреевичем Старицким: он был обвинен в намерении отравить царя и казнен вместе со своими слугами, а его мать Ефросинию Старицкую утопили вместе с 12 монахинями в реке Шексне.
