С получением монаршего одобрения план должен был быть приведен в исполнение немедленно. Были написаны и разосланы необходимые распоряжения. Герцог де Гиз получил задание подвести своих людей к отелю «де Бетизи» и убить адмирала. Вызвали Ле Шаррона, прево торговой гильдии, и сообщили ему, что войска гугенотов в данный момент находятся уже на подходах к городу. Ле Шаррон получил приказ мобилизовать ополчение, закрыть все крепостные ворота и охранять прочие выходы из города. Поперек Сены выставили баржи, скрепленные цепями, чтобы устранить возможность бегства водным путем. Для защиты домов самих ополченцев к каждому из них был направлен вооруженный стражник с белой повязкой на правой руке, они стояли у дверей с зажженными факелами. Горожанам-католикам раздали оружие для самозащиты, а перед ратушей поставили пушки. Собственно убийствами должны были заняться личные телохранители короля и войска Гизов, руководимые Гизом, Омалем, Невером, Таванном и Ангулемом, внебрачным сыном Генриха II.
Сигналом к началу акции — убийству Колиньи — должен был служить звон колокола на Дворце Правосудия в три часа утра. Вышло так, что на звоннице Сен-Жермен-л'Оксеруа ударили в колокол минутой раньше, и бойня началась. В мемуарах Таванна описывается, как непосредственно перед роковым ударом колокола Екатерина вдруг заколебалась. Вероятнее всего, что опасалась она не угрызений совести, а провала операции. То, что Колиньи и другие люди обречены на смерть, Екатерину беспокоило мало. Убийство протестантского вождя она считала необходимым практическим мероприятием, требующим решительности и выдержки. Эти качества, отметим, в полной мере проявлялись у нее, когда речь шла о защите династии Валуа.
Людям Гиза понадобилось всего лишь несколько минут, чтобы, выйдя из Лувра, оказаться возле отеля «де Бетизи». Гиз, верный известному принципу «хочешь сделать хорошо, делай сам», лично возглавил отряд. Де Коссен, верный слуга Гизов, капитан гвардейцев, которые со вчерашнего дня охраняли отель, вошел в дом адмирала и сообщил, что явился гонец от короля, требующий срочно поговорить с ним. Ничего не заподозрив, дворецкий Колиньи спустился отпереть дверь, и де Коссен тут же заколол его кинжалом. Одному из швейцарских гвардейцев, приставленных к адмиралу Генрихом Наваррским, удалось взбежать наверх. Он сдвинул тяжелый комод и забаррикадировал дверь спальни адмирала. Услышав шум, искушенный в схватках Колиньи, понял, что это конец. Он попросил халат, оделся и велел Мерлену, капеллану, молиться вместе с ним. Амбруаз Паре, по случаю находившийся там, обратился к адмиралу со словами: «Сударь, Господь призывает вас к себе, двери взломаны, и некому нас защитить». Адмирал отвечал: «Долгое время я готовился к смерти; спасайтесь, ибо меня вам уже не спасти. Я вручаю душу свою Господней милости». Адмирал бесстрашно ждал своего часа, а Телиньи выкарабкался на крышу в надежде привести помощь, но был застрелен снизу со двора. Амбуаза Паре и других не тронули.
Устранив все препятствия, швейцарские гвардейцы герцога Анжуйского вместе с де Коссеном поднялись по лестнице, но там наткнулись на швейцарских же гвардейцев короля Наваррского. Наемники не стали стрелять друг в друга. Тогда де Коссен велел своим телохранителям, людям Гиза, вышибить дверь, и они ворвались в спальню Колиньи со шпагами в руках. Один спросил: «Вы адмирал?» «Я», — ответил тот и, взглянув на него с отвращением, добавил: «Меня, по крайней мере, должен убить дворянин, а не этот подонок!». Подонком тот человек и был, потому что, заслышав эти слова, вонзил старику в грудь шпагу, а потом ударил по голове. Затем тело адмирала выбросили в окно. Утверждают, что он все еще был жив, ибо попытался уцепиться пальцами за подоконник, но не смог и упал на плиты двора, у ног герцога де Гиза и Ангулема. Гиз пригляделся к окровавленному лицу трупа и воскликнул: «Ей-богу, это он!» Потом удовлетворенно пнул тело, вскочил на коня и отбыл вместе с Ангулемом.
Начались убийства и в Лувре, где поселились многие знатные гугеноты, приехавшие на свадьбу Генриха. Вечером 23 августа Марго находилась в покоях матери вместе со своей сестрой, Клод, герцогиней Лотарингской. Новоиспеченная королева Наваррская обратила внимание на странные приготовления, указывающие на то, что затевается что-то недоброе. В мемуарах Марго пишет: «Что же до меня, то мне никто ничего не объяснил». Она уже попала в ситуацию, которой так опасалась: не признанная протестантами из окружения ее мужа, она теперь оказалась под подозрением у собственных родственников. Нельзя было не замечать перешептывания и лихорадочную активность вокруг, однако и клика матери, и приближенные мужа держались с Марго отчужденно. В своих мемуарах она описывает эту ужасную ночь:
