Мать выкупила сына у наследников мужа. Оставшись с очень скромным доходом, она перевела Николая из московского пансиона в более дешевый пансион в Воронеже. Через два года будущий историк был отчислен из пансиона за плохое поведение, перешел в Воронежскую гимназию, которую окончил в 1833 году, и поступил сперва в Московский, а потом в Харьковский университет на историко-филологический факультет. В гимназии и позднее в университете Костомаров выучил украинский язык и полюбил украинский фольклор. После окончания университета в 1836 году Костомаров поступил юнкером в Кинбургский драгунский полк, но скоро его оставил и в 1837 году вернулся в Харьковский университет для подготовки к профессорскому званию.
В 1840 году он выдержал экзамен на магистра русской истории, но его первая магистерская диссертация «О причинах и характере унии в Западной России» (1842) была уничтожена по распоряжению министра народного просвещения С.С. Уварова из-за доноса архиепископа Харьковского Иннокентия о возмутительном содержании книги и отрицательного отзыва петербургского профессора Н.Г. Устрялова. Но в переработанном виде эта диссертация потом дважды была напечатана, хотя и под другими названиями.
В начале 1844 году ему удалось защитить вторую магистерскую диссертацию «Об историческом значении русской народной поэзии» (1843). Костомаров собирал русский и украинский фольклор. В 1843 году он стал преподавателем истории в мужском пансионе Зимницкого в Киеве. Затем преподавал в гимназии в Ровно в 1844 году, в 1‐й киевской гимназии, в Образцовом женском пансионе и в Институте благородных девиц в Киеве в 1845 году, а в 1846 году стал адъюнкт-профессором Киевского университета, где читал лекции по русской истории. Также Костомаров стал одним из руководителей Кирилло-Мефодиевского братства, члены которого хотели объединения всех славянских народов в виде федерации, с автономией славянских земель, включая Украину (Малороссию), с отменой крепостного права и принятием конституции. Весной 1847 года члены братства были арестованы вследствие ряда доносов. Костомаров был арестован 29 марта и заключен на год в Алексеевский равелин Петропавловской крепости. «За составление тайного общества, в котором обсуждаемо было соединение славян в одно государство», Костомаров был выслан на службу в Саратов, с запрещением печатать свои произведения. Здесь он был определен переводчиком губернского правления; но переводить ему было нечего, и губернатор поручил ему заведывание сперва уголовным, а потом секретным столом, где сосредоточены были в основном раскольничьи дела. Он также редактировал «Саратовские губернские ведомости».
В 1856 году было отменено запрещение печатать сочинения Костомарова. С 1858 года в качестве делопроизводителя Саратовского губернского комитета по улучшению быта крестьян он участвовал в подготовке крестьянской реформы. Весной 1859 года Петербургский университет избрал Костомарова экстраординарным профессором русской истории. Дождавшись закрытия Комитета по крестьянским делам, Костомаров отбыл в Петербург. Однако первоначально он не был утвержден в должности, так как Александру II доложили, что Костомаров написал неблагонадежное сочинение о Стеньке Разине. Но император сам прочел монографию «Бунт Стеньки Разина», отозвался о ней очень одобрительно и разрешил утвердить Костомарова профессором.
